क्रिस्पर केस9 : पशुधन उत्पादन में क्रांति लाने की क्षमता वाली एक जीन संपादन तकनीक
श्वेता शर्मा, पूनम यादव, अंकित शर्मा, ज्ञानेंद्र सिंह, विक्रांत सिंह चौहान*
फिजियोलॉजी और क्लाइमेटोलॉजी डिवीजन, आई. सी. ए. आर.- भारतीय पशु चिकित्सा
अनुसंधान संस्थान (आईवीआरआई) बरेली, उत्तर प्रदेश -243122
* संबंधित लेखक: vikrantchouhan@gmail.com
जीनोम एडिटिंग एक प्रकार की जेनेटिक इंजीनियरिंग है जो वैज्ञानिकों को किसी जीवित जीव के जीनोम में डीएनए डालने, हटाने, संशोधित करने या बदलने की अनुमति देती है। इस तकनीक में वृद्धि दर, रोग प्रतिरोधक क्षमता और दूध उत्पादन जैसे बेहतर गुणों वाले पशुओं के निर्माण को सक्षम करके पशुधन उद्योग में क्रांति लाने की क्षमता है।
जानवरों के जीनोम को वर्तमान में ZFNs (जिंक-फिंगर न्यूक्लिअस), TALENs (ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-लाइक इफ़ेक्टर न्यूक्लिअस), CRISPR-Cas9 (क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/ केस 9) सहित अत्याधुनिक तरीकों का उपयोग करके बदला जाता है।
जिंक-फिंगर न्यूक्लीएज (जेडएफएन) डीएनए-क्लीविंग डोमेन को जिंक फिंगर डीएनए-बाइंडिंग डोमेन से जोड़कर बनाए गए सिंथेटिक प्रतिबंध एंजाइम हैं। जिंक-फिंगर न्यूक्लिअस जटिल जीनोम के भीतर अलग-अलग क्षेत्रों को लक्षित कर सकते हैं क्योंकि जिंक फिंगर डोमेन को कुछ वांछित डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने के लिए तैयार किया जा सकता है। इन रसायनों का उपयोग अंतर्जात डीएनए मरम्मत प्रणाली का उपयोग करके उच्च प्रजातियों के जीनोम को सटीक रूप से संशोधित करने के लिए किया जा सकता है।
ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-लाइक इफ़ेक्टर न्यूक्लीएज़ (टैलेन) प्रतिबंध एंजाइम हैं जिन्हें डीएनए के विशिष्ट अनुक्रमों को काटने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। वे डीएनए-बाइंडिंग टीएएल इफ़ेक्टर डोमेन को डीएनए क्लीवेज डोमेन (एक न्यूक्लीज़ जो डीएनए स्ट्रैंड्स को काटता है) के साथ जोड़कर बनाए जाते हैं। न्यूक्लिअस और ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-लाइक इफ़ेक्टर्स (TALEs) का उपयोग करके डीएनए को विशेष स्थानों पर काटा जा सकता है, जिसे वस्तुतः किसी भी वांछित डीएनए अनुक्रम से बांधा जा सकता है।
क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/केस9 (CRISPR/Cas9) एक नवीन तकनीक है जो आनुवंशिकीविदों और शोधकर्ताओं को डीएनए अनुक्रम के कुछ हिस्सों को हटाकर, जोड़कर या बदलकर जीनोम के एक हिस्से को संपादित करने में सक्षम बनाती है। CRISPR/Cas9 तकनीक वायरल संक्रमण से बचाव के लिए बैक्टीरिया द्वारा स्वाभाविक रूप से उपयोग की जाने वाली एक तंत्र पर आधारित है। जब बैक्टीरिया को वायरस डीएनए की उपस्थिति का एहसास होता है, तो यह दो प्रकार के छोटे आरएनए का उत्पादन करता है, जिनमें से एक में एक अनुक्रम होता है जो हमलावर वायरस से मेल खाता है। आरएनए अणु गाइड आरएनए और डीएनए-चॉपिंग प्रोटीन केस9 से बना एक कॉम्प्लेक्स, डीएनए के कुछ हिस्सों को पहचान और काट सकता है, जिससे वायरस निष्क्रिय हो जाता है। लक्ष्य से मेल खाने के लिए गाइड आरएनए को संशोधित करके, यह केस9 न केवल वायरल डीएनए बल्कि किसी भी डीएनए अनुक्रम को सटीक रूप से निर्धारित स्थिति में काटता है।
डीएनए को खोलने और उसे अपने लक्ष्य आरएनए से मिलाने से पहले, केस9 को जीनोम में PAM नामक एक सामान्य अनुक्रम ढूंढना और उससे जुड़ना होगा। यदि मैच सफल होता है, तो केस 9 डीएनए को काटने के लिए दो आणविक कैंची का उपयोग करेगा, जिससे एक उत्परिवर्तन होगा जो जीन को अक्षम कर सकता है। इसे एक अतिरिक्त डीएनए स्ट्रैंड जोड़कर पूरा किया जा सकता है जिसमें आवश्यक अनुक्रम हो। क्रिस्पर केस9 प्रणाली द्वारा कट किए जाने के बाद यह डीएनए टेम्पलेट कटे हुए सिरों के साथ जुड़ सकता है और मूल अनुक्रम को नए से बदल सकता है। संवर्धित कोशिकाओं, स्टेम कोशिकाओं, निषेचित कोशिकाओं और कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं में, यह संभव है।
क्रिस्पर केस9 प्रौद्योगिकी के घटक
- गाइड आरएनए, आरएनए का एक अनुक्रम है जो एक निश्चित जीन के अंदर रुचि के लक्ष्य अनुक्रम से मेल खाने के लिए बनाया गया है।
- पी ए एम (प्रोटोस्पेसर आसन्न रूपांकन) लक्ष्य डीएनए के भीतर एक छोटा अनुक्रम है, जो पहचान स्थल के रूप में कार्य करता है। यह आम तौर पर एक तीन-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम होता है जिसमें 5’ एनजीजी 3’ शामिल होते हैं जिसमें एन किसी भी न्यूक्लियोटाइड (ए, सी, जी, या टी) का प्रतिनिधित्व करता है जिसके बाद दो गुआनिन (जी) न्यूक्लियोटाइड आधार होते हैं।
- Cas9 (CRISPR-associated protein9) एक एंडोन्यूक्लिएज़, एक एंजाइम है, जो न्यूक्लिक एसिड को तोड़ता है। अधिक तकनीकी रूप से, केस9 एक दोहरी आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिएज़ एंजाइम है जो स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेन्स में क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (क्रिस्पर) अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली से जुड़ा है। केस9 एंडोन्यूक्लिएज़ को जेनिफर डौडना और इमैनुएल चार्पेंटियर द्वारा दो आरएनए अणुओं को एक “सिंगल-गाइड आर एन ए” में संयोजित करके एक अधिक प्रबंधनीय दो-घटक प्रणाली में फिर से डिज़ाइन किया गया था, जो कि केस9 के साथ उपयोग किए जाने पर, निर्दिष्ट डीएनए लक्ष्य का पता लगा सकता है और काट सकता है।
क्रिस्पर केस9 कैसे काम करता है ?
एक 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम जो एक कोशिका में एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम से मेल खाता है जिसे शोधकर्ता लक्षित करने का प्रयास कर रहे हैं, का उपयोग गाइड आरएनए को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है। केस9 गाइड आर एन ए कॉम्प्लेक्स को एक कोशिका में प्रवेश करवाया जाता है, जहां यह बेतरतीब ढंग से डीएनए से जुड़ जाता है और अलग हो जाता है। केस9 कोशिका के डीएनए में PAM रूपांकनों [ 5’ से 3’ तक के डीएनए अनुक्रम की जांच करते समय, कोई भी न्यूक्लियोटाइड (जिसे “एन” कहा जाता है) और उसके बाद दो गुआनिन (एन-जी-जी) होते हैं, पैटर्न होता है ] को ढूंढता है और उनसे जुड़ जाता है। केस9 को गाइड आर एन ए द्वारा लक्ष्य अनुक्रम की ओर निर्देशित किया जाएगा। लक्ष्य अनुक्रम लगभग कोई भी अनुक्रम हो सकता है जब तक कि यह PAM रूपांकन के करीब होता है; यह एक नियामक अनुक्रम हो सकता है जिसे शोधकर्ता किसी तरह से बदलना चाहते हैं, या यह जीन के कोडिंग क्षेत्र का एक खंड हो सकता है। एक बार जब यह PAM मोटिफ से जुड़ जाता है तो केस9 डीएनए डबल हेलिक्स को खोल देता है। डीएनए और मेल खाने वाला आरएनए पूरक आधार युग्मन के माध्यम से बंध जाएगा यदि उस साइट पर डीएनए गाइड आरएनए में 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम से बिल्कुल मेल खाता है। केस9 की त्रि-आयामी संरचना बदल जाती है और इसका न्यूक्लिएज़ फ़ंक्शन डीएनए-आरएनए युग्मन द्वारा सक्रिय हो जाता है। PAM साइट से तीन न्यूक्लियोटाइड अपस्ट्रीम स्थान पर, केस9 डीएनए में सटीक कटौती करता है जो दोनों डीएनए स्ट्रैंड को विभाजित करता है। कोशिकाओं में पाए जाने वाले एंजाइमों द्वारा डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए ब्रेक की मरम्मत की जा सकती है। मरम्मत प्रक्रिया स्वाभाविक रूप से त्रुटि-प्रवण है और इसके परिणामस्वरूप ऐसे उत्परिवर्तन होंगे जो जीन को निष्क्रिय कर सकते हैं। क्रिस्पर केस9 तकनीक के उपयोग की एक विस्तृत श्रृंखला है, जिनमें से एक डीएनए को सटीक रूप से ब्रेक करना है। क्रिस्पर-प्रेरित डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए ब्रेक की मरम्मत गैर-होमोलॉगस एंड-ज्वाइनिंग (एनएचईजे) या होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) द्वारा की जा सकती है। एनएचईजे अधिक बार उपयोग किया जाने वाला, तेज़ मरम्मत तंत्र है, क्योंकि कोशिका टूटे हुए डीएनए सिरों को एक साथ जोड़ने के लिए टेम्पलेट का उपयोग नहीं करती है। एचडीआर कम त्रुटि-प्रवण है और ब्रेक की सटीक मरम्मत के लिए एक समरूप डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करता है।
पशुधन में क्रिस्पर केस9 के विशिष्ट अनुप्रयोग
पशुधन में क्रिस्पर केस9 के कई विशिष्ट अनुप्रयोग हैं। इसमे शामिल है:
फाइबर की वृद्धि और लंबाई को बढ़ावा देना – क्रिस्पर केस9 का उपयोग बकरियों में FGF5 जीन को नॉक आउट करने के लिए किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप फाइबर की लंबाई में वृद्धि हुई है और द्वितीयक बालों के रोम की संख्या में वृद्धि हुई है। इससे ऊन वाली बकरियों का विकास हो सकता है जो टूट-फूट के प्रति अधिक प्रतिरोधी होती हैं।
दूध के घटकों का आणविक हेरफेर – क्रिस्पर केस9 का उपयोग उन बकरियों को बनाने के लिए किया गया है जिनमें BLG जीन की कमी है, जो कुछ लोगों में एलर्जी के लिए जिम्मेदार है। इससे उन बकरियों के विकास को बढ़ावा मिल सकता है जो उस दूध का उत्पादन करती हैं जो एलर्जी वाले लोगों के लिए उपभोग करने के लिए सुरक्षित है। क्रिस्पर केस9 का उपयोग उन बकरियों को बनाने के लिए भी किया गया है जो मेलाटोनिन, एक प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट से समृद्ध दूध का उत्पादन करती हैं। इससे स्वास्थ्य को लाभ पहुंचाने वाले दूध का विकास हो सकता है।
प्रजनन प्रदर्शन को बढ़ावा देना – क्रिस्पर केस9 का उपयोग BMPR-1B/FecB और GDF9 जीन में उत्परिवर्तन के साथ बकरियों को बनाने के लिए किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप ओव्यूलेशन दर में वृद्धि हुई और litter का आकार बड़ा हुआ। इससे ऐसी बकरियों का विकास हो सकता है जिन की प्रजनन क्षमता अधिक हो।
मानव रोग के लिए मॉडल का सृजन – क्रिस्पर केस9 का उपयोग जीन में उत्परिवर्तन के साथ बकरियों को बनाने के लिए किया गया है, जैसे CFTR जीन, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस का कारण बनता है, और TNSALP जीन, जो हाइपोफॉस्फेटिया का कारण बनता है। इन पशु मॉडलों का उपयोग इन बीमारियों का अध्ययन करने और नए उपचार विकसित करने के लिए किया जा सकता है।
रोग प्रतिरोधी पशुओं की उत्पत्ति – क्रिस्पर केस9 का उपयोग उन बकरियों को बनाने के लिए किया गया है जो प्रिओन रोगों के प्रति प्रतिरोधी हैं, जो घातक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार हैं। इससे ऐसी बकरियों का विकास हो सकता है जिन्हें पालना और खाना अधिक सुरक्षित हो।
पशुधन में जीनोम संपादन का उपयोग उद्योग में क्रांति लाने की क्षमता रखता है। इस तकनीक में बेहतर गुणों वाले जानवर तैयार करने की क्षमता है, जिससे दक्षता और स्थिरता में वृद्धि हो सकती है। इसके अतिरिक्त, जीनोम संपादन का उपयोग मानव रोग के लिए पशु मॉडल बनाने के लिए किया जा सकता है, जिससे नए उपचारों का विकास हो सकता है। हालाँकि, यह सुनिश्चित करने के लिए कि इसका उपयोग जिम्मेदार तरीके से किया जाए, इस तकनीक से जुड़ी नैतिक चिंताओं के बारे में सार्वजनिक चर्चा करना महत्वपूर्ण है।
संदर्भ
- Crispo, M., Mulet, A. P., Tesson, L., Barrera, N., Cuadro, F., and Santos-neto, P. C. (2015a). CRISPR/Cas9 तकनीक और युग्मकों में सूक्ष्म–सूक्ष्म इंजेक्शन का उपयोग करके मायोस्टैटिन नॉक–आउट भेड़ों की कुशल पीढ़ी। PLoS One 10, e0136690। doi: 10.1371/journal.pone.0136690
- Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E (March 2011). CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके जीन नॉकआउट और सोमैटिक सेल न्यूक्लियर ट्रांसफर। PLoS One 6(3): e19691।
- Fabre, S., Pierre, A., Mulsant, P., Bodin, L., Di Pasquale, E., Persani, L., et al. (2006). स्तनधारियों में ओव्यूलेशन दर का विनियमन: भेड़ आनुवंशिक मॉडलों का योगदान। रेप्रोड. जीवविज्ञान. एंडोक्रिनोल. 4, 20–25। doi: 10.1186/1477-7827-4-20
- Fan, Z., Perisse, I. V., Cotton, C. U., Regouski, M., Meng, Q., Domb, C., et al. (2018). CFTR जीन के CRISPR/Cas9 व्यवधान द्वारा उत्पन्न सिस्टिक फाइब्रोसिस का एक भेड़ मॉडल। JCI इनसाइट 3, e123529। doi: 10.1172/jci.insight.123529
- Fan, Z., Yang, M., Regouski, M., and Polejaeva, I. A., (2019). “माइक्रोइंजेक्शन (न्यूयॉर्क, एनवाई: स्प्रिंगर) में CRISPR/Cas9 प्रणाली और सोमैटिक सेल न्यूक्लियर ट्रांसफर का उपयोग करके बकरियों में जीन नॉकआउट,” 373–390। doi: 10.1007/978-1-4939-8831-0_22
- Han, H., Ma, Y., Wang, T., Lian, L., Tian, X., Hu, R., et al. (2014). CRISPR/Cas9 प्रणाली के माध्यम से मायोस्टैटिन जीन नॉकआउट भेड़ों की एक–चरण की पीढ़ी। फ्रंट. कृषि. विज्ञान. इंजीनियरिंग. 1, 2–5। doi: 10.15302/J-FASE-2014007
- Hao, F., Yan, W., Li, X., Wang, H., Wang, Y., Hu, X., et al. (2018). CRISPR-Cas9-मध्यस्थता वाले जीनोम संपादन का उपयोग करके EDAR जीन उत्परिवर्ती ले जाने वाले कश्मीरी बकरियों की पीढ़ी। इंट. जे. बायोल. विज्ञान. 14, 427–436। doi: 10.7150/ijbs.23890
